Validação de metodologias para o estudo da lipase sensível a hormônio em vacas em lactação

Resumen

Este trabalho objetivou: a) desenvolver técnicas para mensuração da HSL(Lipase sensível a hormônio) em tecido adiposo de vacas em lactação;e b) medir a ativação da HSL por €œsegundos mensageiros€ responsáveis pela fosforilação da HSL Utilizaram-se como substrato emulsões de trioleina radioativa (³H-trioleina). A emulsão foi preparada por sonicação em solução 0,1M de fosfato, pH= 7,0. A utilização da mistura de 2,5mg/ml de fosfatidilcolina e 1,5mg/ml de fosfatidiletanolamina como emulsificante proporcionou as maiores atividades. Obteve-se a enzima por homogeneização,centrifugação a 90.000xg, por 50 min e precipitação a pH= 5,2. Demonstrou-se linearidade da atividade em função da quantidade de enzima e tempo de reação. Obteve-se ativação da HSL in vitro com dibutiril AMP cíclico (dbcAMP), ATP, proteína quinase-A e MgCl₂, sendo estes resultados os primeiros publicados na literatura, com bovinos. Para tecido adiposo de bovinos foram necessárias concentrações de 2mM de ATP e 3 μM de dbcAMP para maximizar a ativação da HSL. Estudos da cinética da HSL demonstraram que o K_m da enzima bovina foi de 0,3 mM de trioleina. A ativação da HSL por dbcAMP, determinada em diversas concentrações de substrato, foi proporcionalmente maior em concentrações próximas ao K_m, sugerindo que a ativação altera a interface enzima-gota de lipídeo. A metodologia parece adequada para medir a atividade da HSL e a ativação da enzima é função do aumento da afinidade da enzima pelo substrato.